胃癌单细胞数据集GSE163558复现(十一)：T细胞亚群细分

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绪论

Hello小伙伴们大家好，我是生信妙技树的小学徒”我才不吃蛋黄“。今天是胃癌单细胞数据集GSE163558复现系列第十一期。第十期咱们使用通过CopyKAT分析蓄意CNV评估上皮细胞良恶性。本期，咱们将对T细胞亚群进行细分。

1.布景先容

德国形而上学家莱布尼茨说过:“世上莫得两片完好意思交流的树叶。”物种是有其各样性的。对于细胞来说雷同如斯。从表面上讲，咱们不错对细胞亚群进行无穷分群。在首次分群时，不错按捺疗营养辨率，雷同在细胞留意之后，咱们也不错进行亚群再细分。其实分群亦然教师咱们对分群“度”的把控以及生物学布景学问的储备。细胞留意前咱们要确保分群数目富饶多，而这个数目频繁是要进步该组织表面的细胞类型数目。在进行亚群细分时，愈加需要广泛的生物学布景学问储备以及对辞别率和再分群次数的“度”的精确把捏。细胞亚群的分群的依据包括：1.细胞异质性（每个细胞皆有独到的抒发模式和功能，皆有我方特有的基因）；2.细胞共性（吞并类型的细胞皆有访佛的抒发模式）；3.生物学基础学问（基于已有的学问，对细胞进行分类已然）。

T淋巴细胞（T lymphocyte）简称T细胞，是由起首于骨髓的淋巴干细胞，在胸腺均分化、发育熟谙后，通过淋巴和血液轮回而分散到全身的免疫器官和组织中弘扬免疫功能 。T细胞分类轮换有多种：按细胞名义分化抗原 (CD)的不同，可分为CD4+和CD8+两大亚群;按T细胞名义受体 (TCR)的不同，可分为αβT细胞γδT细胞;按功能可分为援手性T细胞 (Th 细胞)、禁绝性T细胞 (Ts细胞)、细胞毒T细胞 (CTL或Tc细胞)和迟发型超敏响应T细胞 (TDTH细胞);按扞拒原交接的不同，分为开动T细胞 (naive T cell)、活化的T细胞 (activated T cell)和悲悼性T细胞 (memory T cell);以及区别于传统T细胞的NKT细胞等等。在第一次分群留意中，咱们只留意到了“开动的”T细胞。在这里，咱们对T细胞亚群进行了粗“细分”。

情药商城app2.数据分析2.1 导入数据

当先索要第三期亚群留意后的T细胞数据：

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rm(list=ls())options(stringsAsFactors = F)library(Seurat)library(ggplot2)library(clustree)library(cowplot)library(dplyr)dir.create("9-T")setwd("9-T/") getwd()set.seed(12345)sce.all=readRDS( "../3-Celltype/sce_celltype.rds")table(sce.all$celltype)sce1 = sce.all[， sce.all$celltype %in% c( 'T' )]

2.2 降维分群聚类

细分亚群的过程很粗野，和简略分群一样，即是对亚群的Seurat对象再次走降维分群聚类。

Seurat V5规范过程：

LayerData(sce1， assay = "RNA"， layer = "counts")sce1 <- JoinLayers(sce1)as.data.frame(sce1@assays$RNA$counts[1:10， 1:2])head(sce1@meta.data， 10)table(sce1$orig.ident) sce = sce1sce <- NormalizeData(sce， normalization.method =  "LogNormalize"，                       scale.factor = 1e4)GetAssay(sce，assay = "RNA")sce <- FindVariableFeatures(sce，                             selection.method = "vst"， nfeatures = 2000)  sce <- ScaleData(sce) sce <- RunPCA(object = sce， pc.genes = VariableFeatures(sce)) 

DimHeatmap(sce， dims = 1:12， cells = 100， balanced = TRUE)

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ElbowPlot(sce) 

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录取0.1辞别率，对T细胞进行聚类分群（为什么录取0.1，迎接大家在指摘区或者微信群留言询查）:

sce <- FindNeighbors(sce， dims = 1:15)sce <- FindClusters(sce， resolution = 0.1)table(sce@meta.data$RNA_snn_res.0.1)  set.seed(321)sce <- RunTSNE(object = sce， dims = 1:15， do.fast = TRUE)sce <- RunUMAP(object = sce， dims = 1:5， do.fast = TRUE)mycolors <-c('#E64A35'，'#4DBBD4' ，'#01A187'  ，'#3C5588'  ，'#F29F80'  ，             '#8491B6'，'#91D0C1'，'#7F5F48'，'#AF9E85'，'#4F4FFF'，'#CE3D33'，             '#739B57'，'#EFE685'，'#446983'，'#BB6239'，'#5DB1DC'，'#7F2268'，'#6BD66B'，'#800202'，'#D8D8CD'，'pink')p = DimPlot(sce，reduction = "tsne"，label=T，cols = mycolors) p

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迷水商城2.3 SingleR留意

SingleR是一种用于单细胞 RNA 测序 （scRNAseq） 数据的自动留意轮换。给定具有已知标签的样本（单细胞或块）的参考数据集，它证实与参考的相似性象征测试数据集结的新细胞。

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singleR使用法子：

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需要一个数据库文献，恶魔丘比特购买哪里有购买网址构建SingleR进行单细胞亚群定名的参考数据库

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使用SingleR包内部的SingleR函数即可把数据库内部的细胞亚群留意信息映射到需要定名的单细胞转录组数据集内部。

奏效的运行了SingleR包内部的SingleR函数之后，就不错拿到每个单细胞的具体的身份信息

细目先容请见公众号前期推文：SingleR及数据库资源包celldex简介 。

SingleR包的装置步地有以下两种：

使用devtools包进行装置：

devtools::install_github('dviraran/SingleR')

或者下载土产货装置：

# 装置依赖包install.packages(c("outliers"， "pbmcapply"， "doFuture"))BiocManager::install(c("GSVA"，"singscore"))# 装置SingleR包install.packages("~/SingleR.tar.gz"， repos = NULL， type = "source")

celldex包是singleR自动留意需要的数据库，现在如故上传到Bioconductor，装置轮换如下：

BiocManager::install("celldex")

加载R包：

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library(SingleR)library(celldex)library(dplyr)library(stringr)library(pheatmap)library(ReactomeGSA)library(ggplot2)library(singleseqgset)library(devtools)

动手SingleR留意：

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getwd()load('/home/data/t020505/GSE163558-GC代码版/9-T/hpca.RData')load('/home/data/t020505/GSE163558-GC代码版/9-T/bpe.RData')unique(hpca.se$label.main)unique(hpca.se$label.fine)unique(bpe.se$label.main)unique(bpe.se$label.fine)#bpe.se <- BlueprintEncodeData()#save(bpe.se，file = 'bpe.RData') str(sce)anno <- SingleR(sce@assays$RNA$data，                ref = list(BP=bpe.se，HPCA=hpca.se)，                labels = list(bpe.se$label.fine，hpca.se$label.main)，                clusters = sce@meta.data$seurat_clusters)plotScoreHeatmap(anno，clusters = anno@rownames，show_colnames = T)table(anno$labels)

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使用DimPlot可视化亚群细分之后的情况:

celltype = data.frame(ClusterID=rownames(anno)，                       celltype=anno$labels，                       stringsAsFactors = F) sce@meta.data$singleR = celltype[match(sce@meta.data$seurat_clusters，celltype$ClusterID)，'celltype']table(sce$singleR)p1 = DimPlot(sce， reduction = "tsne"，        group.by = "singleR"，label = T，cols = mycolors，label.box=T) p1

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咱们不错发现，Treg由3群和4群构成，显明还不错细分。此外，由于这里是从T细胞中留意到了一个B细胞（6群），不错望望象征基因抒发情况：

Idents(sce) = sce$singleRVlnPlot(sce，        features = c("CD3D"，"CD3E"，"CD4"，"CD8A"，'MS4A1'，'IGHG1'，'MZB1'， 'CD79A')，        pt.size = 0，        ncol = 4，        cols=mycolors)

小提琴图效果显露，这一群还的确B细胞啊，东谈主工留意如故得匹配考证：

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那么问题来了，T细胞群中为什么会混入B细胞？迎接大家留言或者加入单细胞周更读者群伸开询查。

结语

本期，咱们使用singleR对T细胞亚群进行细分。下一期，咱们将对进行高档分析“细胞通信”。趁机提前预报一下，胃癌系列推文完成后，将开启肺腺癌单细胞数据集GSE189357复现系列，联系视频如故在B站上线

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文献推文详见（单细胞测序+空间转录组描画从癌前病变到浸润性肺腺癌的动态演变）。此外，对于推文实质的进步和优化，迎接大家提难振奋见。谢谢！

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